一、仪器及试剂
1. 仪器:
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(骋别苍别蚕耻补苍迟)、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)
2. 试剂:
(1)细胞裂解缓冲液:
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
(2) 蛋白酶K:称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,-20℃备用。
(3)TE缓冲液(pH 8.0):高压灭菌,室温贮存。
(4)酚,氯仿,异戊醇(25:24:1)。
(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
二、操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12-24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100μl 吸头挑出,凉干,用200μlTE 重新溶解。(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行。)
3.加等量的酚,氯仿,异戊醇(25:24:1)、振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
4.取上层溶液至另一管,加入等体积的氯仿,异戊醇(24:1),振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
5. 取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm,5min。
8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或-20℃保存备用。
10.吸取适量样品于骋别苍别蚕耻补苍迟上检测浓度和纯度。